摘要：

在神经系统的发育过程中，神经元会感知并对大脑原生环境中的生化线索做出反应。这种生态位特异性线索对神经组织的形成和发育至关重要，目前已在神经组织工程中被广泛利用，以开发能够触发预期神经元行为的生物启发支架。特别是各向异性排列纤维，再现了在细胞外环境中发现的延伸轴突束或排列纤维的设计，已经成为引导细胞排列和沿基质主轴延伸以及促进神经元分化的理想候选者。在用于涂层的天然聚合物中，包括真黑素在内的黑素，已被证明具有抗氧化、抗炎、免疫调节和光保护特性。

为了进一步研究真黑素包被的PLA纤维作为细胞培养平台的潜力，能够在新形成的神经元组织中引导细胞的方向性，本研究评估了微纤维对细胞粘附、扩散和成熟的影响。利用人源的SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞评估了这些底物的生物相容性及其对增殖的影响。通过聚焦/扫描电镜（FIB/ SEM）研究SH-SY5Y细胞在PLA纤维上的粘附、形态和扩散，对界面间的相互作用进行了更详细的表征。然后，利用荧光显微镜进一步研究了真黑素涂层和未涂层排列的聚乳酸纤维在细胞-材料界面上引导细胞排列的能力。最后，评估了高密度微纤维对SH-SY5Y分化为更成熟的神经元表型的影响。结果阐明泛黑素基的组合影响涂层和排列PLA纤维在神经细胞的粘附、扩散和成熟。

结果：

SH-SY5Y细胞在PLA和EU@PLA纤维上的活力和增殖能力

为了评估新合成的PLA纤维与SH-SY5Y细胞的真黑素涂层的生物相容性，在体外进行了活/死荧光试（DIV）。结果显示，涂覆和未涂覆的PLA纤维之间的活细胞百分比没有显著差异，在DIV 21和EU@PLA纤维上的细胞增殖显著减少，因此真泛素包被和未包被的PLA纤维具有生物相容性，并支持SH-SY5Y细胞的生长和增殖。

图1 SH-SY5Y细胞在PLA和EU@PLA纤维上的活力和增殖能力

EU@PLA纤维在细胞-材料界面支配细胞排列

为了更好地理解真黑素涂层在引导细胞对齐中的作用，将SH-SY5Y细胞接种在PLA和EU@PLA纤维及其细胞骨架和细胞核上，分别用FITC和DAPI进行荧光标记（图2A）。当聚乳酸纤维涂有真泛黑素时，表现出单向生长。相比之下，未涂覆的PLA纤维上的细胞表现出各向异性的生长（图2A）。通过对同时接种在PLA和EU@PLA纤维上的SH-SY5Y细胞进行的方向性分析，进一步证实了这些结果（图2B）。综上结果表明，真黑素可能确实是在细胞材料界面建立定向细胞生长的关键。

图2 SH-SY5Y细胞在PLA和EU@PLA纤维上的活力和增殖能力

EU@PLA纤维影响细胞的形态和扩散

涂层纤维和未涂层纤维都能使细胞呈纺锤形形态。然而，真黑素涂层的存在对于进一步刺激细胞扩散是至关重要的，这表明真黑素可能鼓励SH-SY5Y细胞积极探索其周围环境，从而导致面积的增加和更扩散的形态。真黑素涂层在促进细胞沿基质主轴排列和触发SH-SY5Y细胞成熟为更成熟的神经元表型（在细胞培养基中不添加生长因子）中也是必不可少的。

图3 SH-SY5Y细胞在PLA和EU@PLA纤维上的扩散、伸长和粘附

PLA和EU@PLA纤维可促进SH-SY5Y细胞的分化

评估了有无真黑素涂层的高密度排列PLA纤维（#/µm=0.9）促进SH-SY5Y细胞分化和支持神经元成熟的细胞骨架组织的能力。SH-SY5Y细胞培养真黑素涂层纤维显示增加表达水平的神经标记NeuN和GAP-43以及增加神经元细胞骨架蛋白MAP-2和βIII-tubulin。细胞固定后，在JuLI™ Stage活细胞成像仪或共聚焦激光扫描显微镜下10倍放大观察。

图4 SH-SY5Y细胞在PLA和EU@PLA纤维上成熟

结论

生物启发支架的化学和地形特性可以有效地调整，为界面细胞提供指导线索。这些发现，加上真黑素的物理化学性质和离子-电子混合电导率，可能为使用黑色素材料作为生物医学应用提供新的思路，如神经组织工程、组织再生、生物电子学和抗氧化治疗等。