细胞增殖

   细胞增殖实验常用方法包括细胞计数法、MTT法、BrdU染色法、CCK-8法、克隆形成法，这些实验通常需借助显微镜和分光光度计完成。以上方法需频繁拿出细胞，那么有什么新方法可以弥补这种不足呢？本文将介绍一种新的方法——使用活细胞成像系统，置于培养箱内实时动态成像，监测细胞的增殖情况。我们分析了新方法对比常用方法的优势，同时列举了几篇活细胞成像分析系统应用在细胞增殖方向的高分文章，这些文章发表于《Nature communications》、《Science translational medicine》、《Cell Reports》期刊。该方法获得了科研人员的认可，在细胞增殖实验中被广泛使用，新方法的可靠性得到了证实。

         细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学、肿瘤生物学、药理和药代动力学等研究领域。常见的细胞增殖检测方法有以下5种。

1. 细胞计数法

         细胞增殖表现为细胞数目的增多，通过计数板和细胞计数仪得出细胞数目，绘制生长曲线。

              操作方法：一般过程为接种细胞，分组培养7天，逐日检测细胞数量，根据细胞数量绘制成图，即为细胞生长曲线。

              不足：操作繁琐，需频繁将细胞拿出培养箱，不适合数量较多或特定亚群的细胞计数。

2. MTT法

   活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

      简易流程：

              1. 接种细胞：制备细胞悬液，将细胞接种到多孔板中。

              2. 培养细胞：培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

              3. 显色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液。继续孵育，加DMSO，使结晶物充分融解。

              4. 比色：在 490nm波长下检测吸光值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

              不足：工作量大，且溶解甲瓒的有机溶剂有毒性，对细胞造成损伤。

3. BrdU染色法

         BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。通过检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。

              简易流程：

              1. 对细胞进行接种，根据不同条件进行药物处理。

              2. 制备适量BrdU培养基，孵育。除去培养液，用PBS洗涤。

              3. 加入多聚甲醛常温固定，PBS冲洗。

              4. 加入含 Triton X-100的PBS，在冰上将细胞膜穿刺，加入预冷的PBS冲洗。

              5. 加一抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1：50)，阴性对照加PBS或血清。

              6. 按ABC法进行检测，苏木素或伊红衬染，在显微镜或活细胞成像系统下拍照。

              不足：破坏细胞结构，准确性较低。

4. CCK-8法

         CCK-8试剂中含有WST–8，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的Formazan。用酶标仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

              简易流程：

              1. 将处理过的细胞胰酶消化后计数，接种1000个细胞至96孔板，每孔100 μL培养基，将培养板置于培养箱中培养0h、24h、48h和72h。

              2. 每孔加入10 μL CCK-8溶液，用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

              3. 在细胞培养箱内继续孵育0.5h，用酶标仪在450nm测定吸光度。

              不足：CCK-8价格较贵，且试剂颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，操作过程中容易多加或漏加。

5. 克隆形成法

         细胞在体外增殖，形成集落，集落的大小和数量反应该细胞独立生存能力和增殖能力，从而反映细胞增殖的情况。

      简易流程：

              1. 接种细胞于六孔板中，轻轻混匀后放入培养箱中培养。

              2. 培养过夜后，根据实验目的加入药物或其他处理。

              3. 每隔一定时间更换一次培养基，培养2周后，去除培养基，加入PBS洗一次。

              4. 加入多聚甲醛或者乙醇固定，去除培养基，加入结晶紫染色液，常温染色。

              5. 加入PBS洗3次，将六孔板放入烘箱中烘干，对克隆细胞进行计数和拍照。

              不足：培养时间长，操作繁琐，频繁取出观察，影响细胞生长环境。

          综上所述，传统的细胞增殖检测方法，操作繁琐，需频繁将细胞拿出培养箱，且个别试剂会对细胞结构造成影响。耗时、耗力、实验成功率不能保证，最终影响实验效率。

         那么​，有什么新工具可以弥补这些不足，助力细胞增殖实验呢？

         奎克泰生物的JuLI™系列实时活细胞成像分析仪能够放置于培养箱内，对细胞进行实时观察、拍摄记录生长周期的全过程，在保证细胞生长环境稳定的情况下，同时对细胞计数、拍照，形成视频，分析融合度与生长曲线，提供细胞增殖量化结果。

操作繁琐，需频繁拿出培养箱，耗费人力

细胞计数法

MTT法

需染色，且使用的有机溶剂有毒

需染色，且试剂会破坏细胞结构，降低准确性

BrdU染色法

需染色，试剂价格较贵

CCK-8法

操作繁琐，需频繁取出样本观察，影响细胞生长环境

细胞克隆形成法​

新方法-活细胞成像系统​

可长期放置于培养箱， 保证细胞稳定生长环境，操作简单

         对比传统的细胞增殖检测方法，这样的自动化设备大大缩减了人工操作的繁琐性、提高了实验结果的准确性、成功率，省时省力，为研究人员带来了便利。

         以下来自世界各地知名机构发布的4篇文章中，均为使用JuLI™系列活细胞影像分析仪做的细胞增殖实验：

         1. 来自西班牙国家癌症研究中心（CNIO）和德国癌症研究中心（DKFZ）的研究人员在国际杂志《Nature communications 》发表题为“Plk1 overexpression induces chromosomal instability and suppresses tumor development”的论文，研究人员在没有多西环素（–Dox）或存在多西环素（+Dox）的情况下，使用JuLI™ FL观察了MEFs细胞在7天内的增殖情况，以细胞融合度表示。结果显示在MEFs细胞中诱导Plk1的中或高表达，会抑制MEFs细胞的增殖。

         2. 来自重庆医科大学第一附属医院耳鼻喉科的朱江团队在国际期刊《Genes & Diseases》发表题为“Cell cycle dysregulation with overexpression of KIF2C/MCAK is a critical event in nasopharyngeal carcinoma”的文章，研究人员测定了敲低KIF2C后的HNE-1与CNE-1的细胞增殖情况，研究中使用JuLI™ Stage拍摄，以细胞融合度来表示。结果显示敲低KIF2C会抑制HNE-1与CNE-1的增殖。

         3. 来自德国科隆大学内科一部的研究团队在《Cell Reports》发表题为“The Cdkn1a          Mouse as a Tool to Study p53-Mediated Tumor Suppression”的文章，研究人员测定了从WT和Cdkn1a          小鼠分离出来的MEFs细胞的增殖潜力，使用JuLI™ Br观察MEFs细胞连续44天，结果显示两者MEFs细胞的增殖潜力相同。

         4. 来自韩国科学技术研究所医学科学与工程学院的研究团队在《Science Translation Medicine》发表题为“Lactation improves pancreatic β cell mass and function through serotonin production”的论文，将胰岛素免疫染色的石蜡包埋的胰腺切片用JuLI™ Stage扫描成像并计算细胞增殖率。与对照组相比，实验组细胞增殖率显著下降。

             参考文献

             [1] de Cárcer G, Venkateswaran S V, Salgueiro L, et al. Plk1 overexpression induces chromosomal instability and suppresses tumor development[J]. Nature communications, 2018, 9(1): 3012.  (IF17.6)

             [2] Zuo X, Meng P, Bao Y, et al. Cell cycle dysregulation with overexpression of KIF2C/MCAK is a critical event in nasopharyngeal carcinoma[J]. Genes & Diseases, 2021.  (IF7.2)

             [3] Torgovnick A, Heger J M, Liaki V, et al. The Cdkn1a         mouse as a tool to study p53-mediated tumor suppression[J]. Cell reports, 2018, 25(4): 1027-1039. e6.  (IF8.8)

             [4] Moon J H, Kim H, Kim H, et al. Lactation improves pancreatic β cell mass and function through serotonin production[J]. Science translational medicine, 2020, 12(541): eaay0455.  (IF19.3)