传统经典的细胞培养方法，如细胞培养半数感染量（CCID50）检测，是目前在病毒疫苗生产过程开发过程中用于测量病毒感染滴度的耗时的终点检测。然而，CCID50检测法不适合处理高通量和大规模筛查分析所需的大量测试。实时细胞分析（RTCA）系统可用于测量基于阻抗的电信号，从而提供体外细胞层生物状态的信息。基于阻抗的生物传感技术可在无标记系统中提供细胞的定性和定量信息，包括细胞数量、细胞粘附和扩散情况以及细胞存活率。细胞形态和生长速度的变化，又称为细胞病理效应 (CPE)，是病毒感染的早期指标，通过测量阻抗对这些事件进行量化可用于跟踪和描述病毒的生长动力学。

赛诺菲巴斯德公司研究者成功利用黄热病（YF）减毒活疫苗株17D作为嵌合YF DEN (CYD)疫苗的骨架，开发出了可预防四种登革热血清型（DENV-1-4）的疫苗。在疫苗病毒生产开发过程中，研究者将RTCA病毒滴定测定法作为CCID50法的替代方法进行评估，从而发现RTCA病毒滴定测定法和CCID50法结果之间的相关性，并对比两种方法的时间和成本。

实验结果：

估算单价CYD疫苗病毒标准稀释液的 CITmed（median CI）。RTCA检测（细胞指数，CI）显示了感染CYD4的Vero细胞与未感染的对照Vero细胞在96孔e板上测量细胞生长差异。而RTCA检测基于电阻抗原理无法获得实时细胞变化图像，与JuLI™ Stage实时活细胞成像分析系统联合使用，延时图片显示了病毒感染对细胞形态和细胞死亡的细胞病变影响。

图1 单价CYD病毒感染后的实时细胞监测

研究结果显示，病毒浓度越高，CI下降越快，显示出病毒的剂量反应。通过多次实验结果证明CCID50和RTCA检测结果高度相关。

图2 RNA-seq 分析显示 PHF6 是滋养外胚层基因的转录激活剂

RTCA病毒滴定的稳健性研究。研究发现，CI曲线对细胞播种数量、细胞传代次数、细胞播种与病毒感染之间的时间以及培养基类型都很敏感。

图3 PHF6 激活滋养层基因以确定滋养外胚层谱系

用于CYD滴定的CCID50和RTCA检测时间和成本比较。对CCID50和RTCA检测所需的材料和试剂的时间和成本进行分析表明，对于相同数量的CYD样品，与CCID50检测相比，RTCA滴定检测的操作时间降低了5倍，成本，包括操作时间、试剂、消耗品降低了3.5倍。CCID50检测法只有在使用免疫检测方法标记细胞后才能得到结果，而RTCA检测法可以得到实时结果。

结论：

•病毒感染滴度可以使用实时细胞分析（RTCA）来确定。

•Vero细胞病毒感染后阻抗信号降低是剂量依赖性的。

•RTCA是一种可重现且稳定的高通量病毒滴定方法。

•RTCA可用于病毒疫苗工艺开发。