表观遗传调控对于在早期发育过程中建立谱系特异性基因表达很重要。尽管已经对滋养外胚层重编程的调节信号通路进行了充分研究，但对具有组蛋白修饰动力学的滋养外胚层基因的表观遗传调控知之甚少。在这篇文章中，研究者发现植物同源染色体指蛋白 6 (PHF6) 是激活滋养层基因的关键表观遗传调节因子。PHF6作为E3泛素连接酶，通过其扩展的植物同源结构域1（PHD1）对H2BK120（H2BK120ub）进行泛素化，而PHF6扩展的PHD2则识别H2BK12（H2BK12Ac）的乙酰化。研究表明PHF6识别H2BK12Ac对于H2BK120ub 的 E3 泛素连接酶发挥活性作用至关重要。

实验结果

缺乏 PHF6 会影响滋养层外胚层的重编程。为了研究PHF6在早期发育过程中的潜在作用，我们生成了PHF6  KO ESCs，并探讨PHF6 的缺失是否会影响ESC的多能性和分化。研究证明，WT 和 Phf6 KO ESCs 的细胞生长速率没有显著差异。此外，通过测定WT 和 Phf6 KO ESC 之间的碱性磷酸酶 （AP） 活性和转录组学以确定PHF6 对 ESC 多能性的影响，表明 PHF6 缺陷不影响 ESC 多能性。研究者对通过 DOX 或 RA 处理显著上调的基因进行了GO分析，结果表明DOX 处理下 Phf6 KO 的 DEGs 在胎盘发育中显著富集，而 RA 处理下 Phf6 KO 的 DEGs 未显示富集功能，表明 PHF6 以谱系特异性方式发挥作用，并在滋养外胚层重编程中起重要作用。

图1 Phf6 的缺失会导致造血干细胞的滋养层分化出现缺陷

PHF6 是滋养层基因的转录激活因子。通过k-means聚类测量了 WT 和 Phf6 KO ESCs 之间 DOX 反应的差异。聚类 1 显示 WT 和 Phf6 KO ESC 之间的 DOX 反应差异最强，表明簇 1 内基因表达的调节高度依赖于 PHF6。簇 1 内的基因表达在 ESC 状态 （-DOX） 中 WT 和 Phf6 KO 之间几乎没有差异，但在重编程状态 （+DOX） 诱导后 Phf6 KO ESC 显著降低。此外，我们还发现 DOX 抑制簇（簇 2 和 4）的 WT 和 Phf6 KO 之间的差异表达不如 DOX 激活簇高。簇1最重要的GO结果是胎盘发育，这在生物学上与滋养外胚层重编程相关。这些结果表明，PHF6 在滋养外胚层重编程过程中起转录激活剂的作用。

图2 RNA-seq 分析显示 PHF6 是滋养外胚层基因的转录激活剂

PHF6 激活滋养层基因以确定滋养外胚层谱系。研究团队通过生成胚胎体（EB）来确定 PHF6 在分化过程中的作用。在这里，研究团队借助JuLI™ Stage实时活细胞成像分析系统跟踪 ESC的生长变化情况，每 12 小时拍摄一次，记录细胞形态以及汇合情况。结果表明与对照组比，Phf6 KO EBs 未能形成外细胞层。用滋养外胚层标志物 CDX2 抗体对 WT EB 进行免疫染色，显示 CDX2 在 EB 的细胞外层高度表达。在Phf6 KO EBs分化过程中滋养外胚层基因（包括 Cdx2、Plac1、Ascl2 和 Gata2 ）的 mRNA 水平与 WT EBs 相比不显著。这些数据表明，PHF6 对于滋养外胚层基因的转录激活以分化为滋养外胚层谱系至关重要。

图3 PHF6 激活滋养层基因以确定滋养外胚层谱系

PHF6 通过识别 H2BK12Ac 来调节 H2BK120ub 的水平。研究者对从 ZHBTc4 ESCs 提取的组蛋白以及重组蛋白（包括 GST-PHF6）进行了蛋白印迹分析，检测 PHF6 与组蛋白之间的相互作用，以及 PHF6 可识别的潜在特定组蛋白修饰。结果发现，组蛋白H2B和H3选择性地与重组GST-PHF6蛋白相互作用。通过体外肽结合阵列证实了 PHF6 与组蛋白 H2B 和 H3 肽的特异性结合。富集度排名前五位的组蛋白修饰是 H2BK15Ac、H3K27Ac、H2BK12Ac、H3R26me2a 和 H3K27me2。此外，我们对每种 H2B 或 H3 修饰进行了pull down实验，以鉴定 PHF6 识别的特定组蛋白修饰，并证实 PHF6 在体外特异性结合 H2BK12Ac。后续通过WB、qRT-PCR等证明PHF6 特异性调节 H2BK120ub 水平，以促进滋养外胚层基因的转录激活。

图4 PHF6 通过识别 H2BK12Ac 来调节 H2BK120ub 的水平

PHF6 具有组蛋白 H2BK120 的 E3 泛素连接酶活性。通过体外泛素化测定实验，当 UBCH3 而不是 UBCH6 作为 E2 伴侣一起工作时，PHF6 作为 E3 泛素连接酶发挥作用。此外，在引入 H2BK12R MT 后，PHF6 无法泛素化 H2BK120，这进一步证实了 PHF6 是通过先于 H2BK12Ac 识别 H2BK120ub 的 E3 泛素连接酶。

图5 PHF6 是一种乙酰依赖性 E3 泛素连接酶，可连接 K120 上的组蛋白H2B

PHF6 对通过 H2BK120 泛素化激活滋养层基因至关重要。通过MNase-ChIP 分析发现PHF6 E223S MT 与 H2BK12Ac单核糖体的结合显著降低，而 PHF6 WT 和 E3 连接酶 MT M125A 保留了 H2BK12Ac单核糖体结合能力。此外对使用或不使用DOX处理的WT和Phf6 KO ESCs中Cdx2和Gata2的启动子进行了ChIP检测。在WT ESCs中，DOX处理导致PHF6招募增加，同时这些基因启动子上的H2BK120ub水平也增加，但在Phf6 KO ESCs中却没有出现这种情况。qRT-PCR分析显示，与PHF6 WT重组的Phf6 KO ESCs中的靶基因相比，在Phf6 KO ESCs中重组PHF6 MTs未能诱导包括Cdx2、Ascl2、Wnt7b、Fgfr2和Plac1在内的滋养层外胚层基因的mRNA水平。

图6 PHF6 在 H2B 上的乙酰化-泛素化串联对于滋养层基因的激活至关重要

结论：

PHF6作为一种E3泛素连接酶，通过PHD2结构域介导的与H2BK12Ac的相互作用，对H2BK120进行单泛素化。结果证明PHF6在造血干细胞向滋养外胚层系分化的过程中起着组蛋白串联的关键调节作用。