研究背景

由于缺乏有效的筛查方法，卵巢癌通常在晚期才被确诊，这通常包括广泛的腹膜播散。成功的卵巢癌定位分期和手术中的细胞减灭术已被证明对患者的预后有显著影响。然而，对于腹膜表面多个解剖部位存在大量亚毫米病灶的腹膜播散性卵巢癌而言，精确绘图和细胞剥脱手术往往具有挑战性，可能导致治疗效果不佳和复发。荧光引导手术（FGS）可利用肿瘤靶向荧光团，以足够的特异性和灵敏度定位小肿瘤病灶，帮助实时可视化小的癌症病灶和边界，从而提高癌症的手术和预后疗效。尽管成像设备稳步进步，但可用于实现最佳 FGS 的荧光团仍然稀缺。

研究目的

在本研究中，报道了一个快速作用的pH敏感荧光团PH08，以突出具有高TBR的小肿瘤病变。这种新型的NIR荧光团在酸性TME值中通过减少分子内猝灭而表现出快速的信号增加。此外，为了解决荧光团缺乏靶向机制的历史问题，在化合物的化学结构中引入了固有的癌症靶向，即FGS的“结构固有靶向（SIT）”策略。通过使用不同的聚甲基结构的烷基引入不同的表面电荷和亲脂性，PH08对有机阴离子转运肽（OATPs）表现出内源性亲和力，主要通过OATPs进入癌细胞，并长时间保留在线粒体和溶酶体中。此后，在小鼠中使用了卵巢癌的原位模型，合理地模拟了人类疾病的部位特异性病理。通过局部应用合理设计的PH08，可以观察到在给药后的4个多小时内，无需清洗即可在10分钟内观察到微小的腹膜扩散，从而实现实时FGS。

研究方法

1）设计了一种pH敏感的近红外荧光团，在由分子内淬灭减弱引起的酸性肿瘤微环境（TME）中表现出快速信号变化

2）引入基于化学结构的癌症固有靶向（结构固有靶向，SIT）

3）NIR荧光团体外成像评价

4）NIR荧光团荧光引导手术（FGS）的体内疗效评价

结果

pH传感NIR荧光团的系统合成及光学表征

为了实现快速和持久的术中成像，研究者合理设计了可激活的NIR荧光团，通过在氰胺类似物的共轭双键附近放置一个氨基来检测轻度低pH，这允许电子离域和减少分子内猝灭。合成方法如图1a所示。图1b-d展示了具有代表性荧光团的光学特性以及pH探针的电子密度分布和分子内猝灭的pH依赖性变化。

图1 pH传感NIR荧光团的化学结构、理化性质和光学性质

pH传感NIR荧光团的毒性

小鼠ID8卵巢癌细胞与不同浓度的PH08孵育来评估细胞活力，PH08仅在高浓度超过3μm时对ID8细胞表现出毒性，这些结果表明PH08可以安全地用于成像。

pH传感NIR荧光团对卵巢癌细胞的靶向性

使用培养的小鼠ID8和人SKOV3和CAOV3卵巢癌细胞系，以及NIH3T3成纤维细胞和C2C12成肌细胞作为正常细胞对照，通过荧光显微镜检测pH传感荧光团PH08的卵巢癌细胞靶向性。PH08在人卵巢癌细胞中的积累量明显高于正常细胞系，但在该实验模型中没有观察到小鼠癌和正常细胞系之间的显著差异。这些结果表明，PH08可以被细胞吸收，并支持了进一步的检测PH08在体内肿瘤成像中的应用。

图2 pH传感NIR荧光团的肿瘤细胞靶向性和细胞毒性

有机阴离子转运体在细胞摄取NIR荧光团中的作用

通过荧光显微镜观察ID8细胞（小鼠卵巢癌细胞系）检测癌细胞对每个荧光团的摄取。结果显示，PH03和PH08在细胞中均以时间依赖性的方式积累，PH08比PH03具有更高的亲和力，其固有的靶向能力来自于化合物的化学结构。使用JuLI™ Stage活细胞成像系统进行实时活细胞成像，获得的图像使用ImageJ测量每个细胞的荧光强度，实验中每个荧光团的所有NIR荧光图像都被归一化。

图3 通过膜转运体感知NIR荧光团的细胞摄取

pH传感NIR荧光团的亚细胞分布

通过体外活细胞成像，评估了NIR荧光团在培养的ID8卵巢癌细胞中的亚细胞定位。结果表明PH08通过转运体进入细胞，并很好地保留在细胞器中。

NIR荧光团荧光引导手术（FGS）的体内疗效评价

评估了pH感应NIR荧光团在卵巢癌小鼠模型中的体内性能。在证实了PH08的体内疗效后，在注射后4h进行了FGS治疗。NIR成像提供了腹膜转移性结节的精确定位，并使医生能够完全切除转移性结节，包括一个小于1mm的小结节。

图5 卵巢癌小鼠模型中pH传感NIR荧光团的肿瘤细胞靶向性的体内评价

总结

合理设计的可活化PH08减少了TME中的分子内淬灭，并可通过OATPs靶向癌细胞，在局部应用后可快速恢复荧光（<10分钟），持久保留在肿瘤细胞的线粒体和溶酶体中（局部应用后至少4小时）。PH08有可能缩短手术时间，降低术后残留肿瘤的可能性。此外，由于PH08是一种小分子，因此它提供了一种可扩展的生产策略，并且很有可能在遵循ICG的安全性和监管准则的前提下，加速获得美国食品及药物管理局的批准，用于肿瘤靶向的临床应用。