台盼蓝排除法目前得到美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）的认可，是细胞治疗中总细胞数和细胞活力评估的标准。然而，随着细胞治疗的发展，对于复杂的细胞样本如免疫细胞、原代细胞和干细胞，台盼蓝方法的局限性越来越明显，其特点是高估了细胞活力、红细胞污染等。
为了应对这些挑战，基于荧光的细胞计数方法被引入。这些技术利用选择性靶向细胞核的荧光染料，不受碎片或红细胞的影响，确保细胞计数和活力评估更加精确。工业生产上迫切需要扩大基于荧光的自动细胞计数仪器的使用，以加快研发速度和生产效率。
意识到这些局限性，韩国食品药品安全部（MFDS）更新了其细胞治疗产品指南，支持使用带有荧光核染色的自动细胞计数仪。NanoEnTek处于前沿，提供全系列先进的自动荧光细胞计数仪。
NanoEnTek 的产品系列包括 ADAM™ MC2/CellT 和 ADAM™ MC Plus/CellT Plus。此外，NanoEnTek 还提供先进的 3 荧光通道细胞分析仪 ADAMII™ LS/CDx。对于需要高通量和高精度的用户，NanoEnTek 的高通量双荧光细胞计数仪EVE™ HT FL 脱颖而出，尤其适用于细胞治疗研究和制造。有了这些先进的自动细胞计数仪，荧光细胞核染色方法为评估细胞治疗过程中的细胞活力提供了更可靠、更高效的支撑。
1. 现行美国 FDA 和 EMA 指南
目前，美国 FDA 和 EMA 认可台盼蓝排除法（手动和自动）作为细胞治疗质量控制的标准方法。然而，这种方法具有局限性，使其不太适合复杂的细胞治疗。例如，与基于荧光的方法相比，基于台盼蓝的活力往往高估了细胞活力，样品中存在的红细胞使总细胞计数不可靠，而基于台盼蓝的手动计数本质上是主观的，并且更具可变性。为了解决这个问题，监管机构已经部分批准了基于荧光的细胞计数方法。
从工业角度来看，扩大基于荧光的自动细胞计数仪器的使用需求不断增长。这样做不仅可以加快研发过程，还可以提高生产效率。将批准范围扩大到包括自动荧光细胞计数仪可以大大提高细胞治疗生产的质量和效率。
2. 传统细胞计数的局限性：台盼蓝排除法
（1）台盼蓝排除法的定义：
台盼蓝排除测定是测定细胞活力的最早和最常用的方法之一。台盼蓝（偶氮染料）染色机制背后的原理是基于细胞膜的差异通透性。
活细胞具有完整且功能性的细胞膜，可选择性地允许某些分子通过。台盼蓝颗粒由于其大小和电荷，可以渗透到无活力细胞受损或受损的膜，进入细胞内空间。
正常情况下，细胞内环境尤其是细胞质，由活跃的过程维持，例如在健康细胞的情况下，ATP 依赖性离子泵和转运蛋白。这些细胞利用 ATP 能量，通过称为胞吐作用的过程主动挤出台盼蓝颗粒，有效地从细胞内空间去除染料并防止细胞被染色。
相反，无活力或死细胞缺乏产生 ATP 的能力，因此无法进行胞吐作用。结果，它们将台盼蓝染料保留在细胞质中，导致它们在显微镜下呈现蓝色或染色。
通过使用这种染色方法，研究人员可以直接识别和计数给定群体中的活细胞（未染色）和死细胞（蓝色）。
（2）台盼蓝排除法的局限性：
过去，基于细胞的研究主要利用永生化细胞系，例如 CHO 细胞。然而随着细胞治疗领域的发展，正在使用更复杂的样本类型，包括原代细胞、外周血单核细胞（PBMC）、干细胞、解离的肿瘤细胞，甚至工程化的 T 细胞。这些细胞的大小、形状和聚集特性各不相同，因此传统的台盼蓝排除法在获得准确结果方面并不完全可靠，尤其是对于 PBMC、干细胞和原代细胞等异质性样品。
以下是台盼蓝排除法的一些局限性：
首先，台盼蓝对哺乳动物细胞有毒。即使是活细胞最终也会被台盼蓝染色，因为有毒染料会渗透到细胞膜中，导致细胞在接触后约 5 至 30 分钟死亡。因此，必须在染料引入后 3 至 5 分钟内进行准确测量。此外，台盼蓝为致癌物，不仅对细胞有害，而且对人类有害，长期接触后可能导致癌症。
此外，台盼蓝可以将死细胞的形态改变，可能导致对活力的高估。用台盼蓝染色后，细胞立即开始破裂，成为弥漫性物体。台盼蓝染色后，一些死细胞可能会消失，导致总细胞计数不足，从而高估细胞活力。换句话说，台盼蓝的毒性会随着时间的推移改变活力，从而影响测量准确性，从而导致低估细胞群活力。
这些不准确之处可能会影响细胞治疗的结果，细胞治疗依赖于对免疫细胞的准确测量，这些免疫细胞将被输回患者体内，此外，突出了对改进解决方案的需求，例如荧光细胞核染色法。
3. 细胞治疗生产过程中荧光核染色方法的必要性
在细胞治疗产品的生产中，从人体血液中提取各种免疫细胞。然而这些细胞经常被红细胞污染，当使用传统的台盼蓝排除方法时，红细胞可能会被错误地识别为死细胞。这种污染延伸到细胞碎片和非细胞颗粒，导致数据偏差。此外，在免疫细胞计数过程中，与 PBMC 混合的红细胞无法区分，导致总细胞计数值不准确。这些不准确之处会显著影响各种免疫细胞治疗（如 CAR-T 和 NK 细胞治疗）的研究、开发和生产，最终影响基于细胞的治疗的整体质量。
此外，与永生化细胞系相比，从血液、组织或器官中提取的原代细胞会带来类似的问题，因为碎片的存在相对较高。这可能导致碎片被错误地计数为细胞，进一步加剧了总细胞计数的不准确性，并降低了基于细胞的疗法的研究、开发、生产和制造的质量。
此外，基于台盼蓝的细胞计数方法的局限性也延伸到其对细胞存活率的影响。总细胞计数值的不一致和不准确直接影响细胞活力评估。例如，在明场显微镜下检查时，免疫细胞（如 PBMC）中丰富的细胞表现出更高的细胞活力变异系数（CV %），因为与传统细胞系（>10μm）相比，它们的尺寸（8μm）更小。
与传统细胞系不同，台盼蓝染色能够区分活细胞（未染色）和死细胞（深蓝色），根据内部亮度确定 PBMC 等较小细胞的活力是一项重大挑战。这一挑战导致用户之间存在显著差异，并且使用传统细胞计数显微镜区分活力的能力较差。
为了缓解这些问题，本司推荐具有细胞核荧光染色技术的自动细胞计数仪。这种方法包括对细胞核进行荧光染色，以获得一致和准确的值，而与细胞大小无关。使用 PI 或 DAPI 等试剂根据染色细胞核的存在对死细胞进行计数，以确保准确性并最大限度地减少外部干扰。
该方法对永生化细胞系和从血液、组织或器官中提取的原代细胞均有效，即使存在碎片或红细胞污染，也能提供一致且准确的结果。使用基于细胞核荧光染色的自动细胞计数方法可确保总细胞计数和活力测量的高精度和最小的外部干扰，从而实现可靠的数据采集并促进研究、开发和过程管理。
4. 韩国：主动修改“细胞治疗产品放行测试指南”
韩国食品药品安全部（MFDS）最近对其“细胞治疗产品放行测试指南”进行了重大更新。此次更新是为了认可荧光核染色方法的准确性和可靠性。因此，使用这种方法的自动细胞计数仪现在被正式认可为有效的测试程序。
该指南的最新版本指出了台盼蓝染色方法的局限性，并正式认可了同时使用荧光细胞核染色法的自动细胞计数仪。这一发展是向前迈出的积极一步，它解决了与审批流程相关的问题，并为使用基于荧光的细胞计数仪进行更准确的细胞计数打开了大门。
随着指南的修改，NanoEnTek 的自动荧光细胞计数仪系列包括ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus、3 荧光通道细胞分析仪 ADAMII™ LS/CDx 和高通量自动双荧光细胞计数仪 EVE™ HT FL，现在可以无缝集成到细胞治疗产品的开发、制造、生产和临床试验中。这种基于荧光的细胞计数方法被认可为有效的检测程序，可确保获得准确可靠的数据，从而有助于细胞治疗产品的整体质量和安全性。
5. NanoEnTek 细胞计数仪：细胞治疗开发和制造的理想工具
荧光细胞核染色方法在细胞治疗产品的制造和质量控制中以其高精度和可靠性而著称。NanoEnTek 的自动荧光细胞计数仪系列，包括 ADAM™ MC2/CellT、ADAM™ MC Plus/CellT Plus 和 ADAMII™ LS/CDx，旨在为总细胞数量及其活力提供精确可靠的结果。
ADAM II 系列能够使用细胞表面标志物 （CD marker） 进行准确的细胞识别和绝对计数。此外，EVE™ HT FL 是一款高通量荧光细胞计数仪，可在短短 3 分钟内处理多达 48 个样品。这种卓越的精度和速度使 EVE™ HT FL 成为广泛应用的理想选择，包括细胞系和原代细胞的分析。
ADAM™ 系列、ADAMII™ 系列和 EVE™ HT FL 是非常适合用于细胞治疗的设备。它们具有高准确性、可靠性和效率，使其成为细胞治疗领域研究、开发和生产工艺不可或缺的工具。
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