免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到实验目的。

基本实验步骤

1. 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

2. 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。

3. 通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min。

4. 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。

5. 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。

6.  二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

7. 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

苏州奎克泰生物为韩国NanoEnTek中国区独家总授权，JuLI系列活细胞成像仪深受赞誉。JuLI Br是一款明场的实时活细胞成像分析仪，实时观察/拍摄/记录细胞生长的全周期。镜头与底座分开，由数据线连接进行数据传输和电源提供；镜头可以放置在标准培养箱中，无需将样本拿出培养箱就可实现实时细胞生长状态观察、监测、记录、分析。通过设置拍摄时长和拍摄时间间隔可以通过视频和照片的方式将细胞全生长过程记录下来，避免错过关键时刻，无需全程守在培养箱旁。任何变化都可以通过培养箱外的底座观察到，底座配有触控屏，可以实时查看细胞状态和操作以获得细胞数量、存活率、浓度、融合度、细胞生长曲线等结果。这一款的计数功能是选配。Br的底座还可以同时连接两个镜头，实现对比实验的实时对照。 JuLI FL是一款带荧光（GFP/RFP）的实时活细胞影像分析仪，与JuLI Br外观一样，Br有的功能FL都具备，且计数功能是FL标配，无需选配。除了Br能实现的细胞计数、监测、拍照、形成视频、融合度、生长曲线等功能，FL还可以测定转染效率等级（GFP/RFP表达水平）。FL同样可以实现一个底座同时连接两个镜头，可搭配一个GFP镜头和一个RFP镜头，就能实现双色荧光+明场。 JuLI Stage是一款全自动活细胞荧光监控系统，具有三色荧光。与Br/FL一样可置于培养箱内实时观察/监测/拍摄细胞生长情况、计数细胞、计算细胞融合度、生成动态影像及生长曲线。Stage的载物台是可以移动的，适用6到384孔板、细胞培养皿、细胞培养瓶及各种玻片等培养耗材。能够实现自动扫描、自动对焦和图像拼接功能。Stage还自配4X、10X和20X三个可替换物镜，可以根据实验需要选择合适的物镜倍数。

转载：

http://www.biomart.cn/experiment/430/502/519/522/22952_1.htm