研究背景

轴的形成和相关的空间模式化是由发育过程中的对称性破坏开始的。人类多能干细胞（hPSCs）的几何限制培养模拟了对称性破坏和细胞模式化。通过这种方法，产生了具有自组织背腹侧（DV）组织的极化脊髓器官组织（pSCOs）。尾端化信号的应用促进了沿径向轴的区域化细胞分化和局限性 hPSC 群体的突起形态发生。这些分离的菌落长成了延伸的脊髓样器质体，通过自发表达极化的DV模式化形态发生因子，沿长轴建立了自序的DV模式化。pSCOs中背侧/腹侧结构域的比例可通过改变微图案的初始大小来控制，这改变了二维中中心-边缘细胞的比例。在成熟的 pSCOs 中，背侧和腹侧可分别检测到高度同步的神经活动，这表明有机体中已建立了功能和结构模式。这项研究提供了一种简单且可精确控制的方法来生成空间有序的有机体，用于了解神经发育过程中细胞模式化和轴形成的生物学原理。

研究方法及成果

1. 背腹极性模式的诱导

通过在玻片上打印微图案（350 µm直径）并采用神经尾部诱导信号（SB431542 和 CHIR99021），实现人胚胎干细胞（hESC）的二维背腹模式化。在三天内观察到：

• 中心细胞高表达神经前体标志物SOX2，而边缘细胞则表达T阳性标志物，表明分区化显著。

• 边缘细胞表现出β-连环蛋白的胞质分布，并通过上调Slug进入上皮-间质转化（EMT）。

2.  三维类器官的生成与模式化

• 在培养6天后，微图案培养的细胞从二维中分离并形成三维类器官，包括基底部分（Bd）和顶部延伸部分（Ad）。

• Bd区域主要形成管状结构，Ad区域形成囊泡样结构。背腹模式通过背侧（PAX3+）和腹侧（Nkx6.1+）标志物分布得到进一步验证。

3. 背腹模式与功能特征

• 单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（ST）分析揭示，类器官中背侧和腹侧区域分别表达对应脊髓背腹轴的特定基因。

• 成熟的pSCO表现出结构上分离的神经网络，背侧区域与感觉处理相关，而腹侧区域控制运动功能。

• 电生理记录表明，这些神经网络具有独立的活动模式，功能区域化特征明确。

4. 微图案尺寸对背腹比例的影响

• 通过调整微图案直径（150–700 µm），研究发现背腹区域的比例和形态变化可被有效控制。较大图案尺寸产生更大比例的腹侧区域。

研究意义

该研究提供了一种利用几何约束和对称性破坏生成具有背腹轴模式化的三维类器官的方法，揭示了人类脊髓发育中细胞模式化和轴形成的生物学机制。这种系统不仅适用于发育障碍建模，还可用于探索神经网络功能的区域化。

未来展望

尽管研究展示了背腹模式的自组织能力，梯度依赖的信号模式化尚未完全重现，未来需要进一步优化培养条件以更好地模拟体内发育过程。

设备应用

延时成像：使用JuLI Stage活细胞实时成像分析系统记录三维结构的形态变化，拍摄总时长超过144h。

定量分析 hESC 群体的运动学和机械动力学：在细胞培养箱中使用JuLI Stage活细胞实时成像分析系统在培养 hESC 群体时同时采集明视野通道的图案细胞群体图像和红色荧光蛋白（RFP）通道的图像。

A) 培养方案示意图。B) SB/Chir 处理第三天菌落形态发生的明视野图像。

A) 从二维微图案菌落中分离出来的三维结构在 bFGF 存在下6 天内的生长情况。上部突出部分标记为 Ad（顶端衍生部分），附着在微图案基底上的部分标记为 Bd（基底衍生部分）。

A) 微图案菌落大小对空间细胞图案化和菌落形态发生的影响。在 SB/Chir 处理的第 3 天，对生长在指定直径微图案上的菌落进行免疫荧光分析和量化。B) SCD3 处突起宽度的量化。