研究意义

本文介绍了一种新的细胞条形码方法，用于追踪细胞谱系。传统方法存在局限性，如难以创建重复拷贝的阵列元素。研究人员受到内源性逆转录病毒基因编辑研究的启发，开发了一种使用nCas9与胞嘧啶脱氨酶融合的碱基编辑方法，该方法能够在不引起双链断裂的情况下，在基因组中的特定区域引入独特的碱基对替代模式。这种方法被应用于长散布核元件-1（L1），并通过单个引导RNA引入多种替代模式，从而实现了细胞谱系的准确追踪。该方法在单细胞水平上得到了验证，并有望为正常细胞发育和分子病理学提供新的见解。

研究结果

本研究首先评估了人类L1逆转座子区域的扩增，通过设计引物和优化PCR方法，减少了扩增偏差，并验证了精确分子标签计数的影响。随后，研究探索了在基因组编辑后使用靶向脱氨酶作为条形码的内源性区域的可能性，筛选并验证了满足条件的sgRNA候选物，并预期这些sgRNA可以在L1区域的多个目标位点引入C-to-T替换作为细胞条形码，通过周围序列区分这些位点，实现唯一比对。

在HEK293T和HeLa细胞的L1逆转座子区域应用了靶向脱氨酶系统，以测试其在谱系追踪实验中的可行性。结果显示，sgRNA-1的编辑效率较低，而sgRNA-3的编辑效率更高，且编辑过程具有连续性。将两个C视为一个编辑位点后，发现不同细胞系和目标位点的编辑效率存在差异。与对照相比，未检测到显著的背景突变，且非目标C的编辑频率非常低。这些结果表明，靶向脱氨酶系统可用于谱系追踪实验，但编辑效率因sgRNA和目标位点而异。

图1 用于谱系追踪的靶向脱氨酶系统

本研究探索了使用靶向脱氨酶系统在目标重复区域连续引入遗传条形码以进行谱系追踪的可行性。通过比较不同的sgRNA和进行细胞扩增实验，研究人员发现sgRNA-3的编辑效率更高，并成功在HEK293T和HeLa细胞中引入了细胞条形码。进一步的研究表明，通过优化单细胞PCR条件，可以在单细胞水平上实现谱系关系的重建。此外，模拟实验表明，编辑速率和目标位点数量对谱系重建的准确性有影响。

在本环节中，研究人员手动挑选RFP（mCherry荧光蛋白）阳性的单细胞进行培养，后用JuLI™ Stage活细胞成像分析系统监测细胞生长情况，对于单个细胞分裂进行监测，便于后续的单细胞测序实验。

图2 谱系追踪实验的累积编辑和分析

实验发现，随着可追溯代数的增加和编辑位点的增多，重建准确性提高。但在达到峰值前，由于条形码累积稀疏和分支间共享不足，准确性增加较快；峰值出现在可编辑位点几乎用尽时，此后准确性提升有限且谱系关系结论模糊。应用30%的脱落率后，准确性有所下降。模拟位点编辑偏倚的影响时，准确性差异无显著变化。

图3 靶向脱氨酶系统的性能模拟

研究结论

研究团队通过体外树状扩增实验和延时成像，证明了使用靶向脱氨酶系统追踪细胞系的概念，为开发一种利用内源性靶点追踪细胞系的替代技术奠定了基础。在未来的研究中，研究人员希望该系统能用于确定不同细胞在转基因模式生物体内器官发育的命运。从长远来看结合转录信息，此方法可以提供高分辨率的发育谱系视图。