1. 实验前准备

1.1 实验材料

细胞类型：口腔肿瘤细胞系

培养基：DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）

补充成分：10%胎牛血清（FBS），1%双抗PIS

细胞培养器具：六孔板、超净工作台、CO₂培养箱

1.2准备基础培养基（50ml）

取适量的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium，44.5ml）。

根据需要，添加10%胎牛血清（5ml）和1%青霉素-链霉素（0.5ml）。

1.3过滤灭菌

将培养基通过0.22 μm的过滤器过滤灭菌，避免细菌和真菌污染。

1.4储存

将配制好的培养基分装到无菌的试管中，贴上标签并存放于4℃冷藏。

2. 实验中步骤

2.1实验材料准备

培养基：DMEM（添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素）。

试剂：0.15%胰蛋白酶（用于消化细胞），PBS（磷酸盐缓冲液）。

细胞培养器具：六孔板、超净工作台、CO₂培养箱。

2.2细胞观察

使用JuLI系列成像仪观察细胞状态，确保达到80-90%融合度，且无明显污染。

若融合度较低，进行细胞换液即可，让细胞再生长。

2.3准备新培养基

预热新鲜培养基至37℃。

2.4细胞清洗：

吸去旧培养基，加入适量PBS（约1 ml），轻轻摇晃以清洗细胞。

2.5细胞消化

加入适量的0.15%胰蛋白酶溶液（约0.5-1 ml），轻轻摇匀。

将细胞放入37℃培养箱中消化1-2分钟，置于成像仪下观察细胞是否开始脱落。

2.6停止消化，细胞收集

当细胞开始脱落时，立即加入等体积的新鲜培养基（1ml）以停止消化。

轻轻吹打皿底以确保细胞完全脱落。

将细胞悬液转移至离心管中，离心1000 rpm，5分钟。

2.7去除上清液，细胞重悬

小心去除离心后的上清液，保留细胞沉淀。

使用新鲜培养基重悬细胞，轻轻吹打均匀。

2.8接种新培养瓶/皿并培养

按照预定细胞密度（如1×10⁴至1×10⁵细胞/ml）接种至新的培养瓶/皿中。

将接种好的细胞放入37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

Tips：

1. 传代频率：通常每3-5天进行一次传代，具体根据细胞生长情况调整。

2. 无菌操作：确保所有操作在无菌环境中进行，以减少污染风险。

3. 使用胰酶消化细胞要把握好时间，切勿消化过度。也可借助成像仪观察细胞形态以掌握消化程度。

4. 细胞状态监测：定期检查细胞生长和健康状况。