墨尔本大学生物化学与分子生物学系研究人员于2020年在Molecular & Cellular Proteomics期刊上发表一篇题为《Arginine in C9ORF72 Dipolypeptides Mediates Promiscuous Proteome Binding and Multiple Modes of Toxicity》的文章。

运动神经元病（Motor Neurone Disease，MND），又被称为肌萎缩侧索硬化症，这是一种损害控制肌肉的神经细胞的疾病，会导致患者肌肉萎缩及乏力，使人活动、吞咽、说话及呼吸机能逐渐瘫痪，最终造成死亡。额颞叶痴呆（Frontotemporal dementia，FTD）是中老年患者缓慢出现人格改变、 言语障碍 及行为异常的痴呆综合征。出现这两种疾病的主要遗传原因在于C9ORF72中GGGGCC六核苷酸重复序列的数量从普通人群中的不到15个增加到20多个（通常为数百个）。毒性通过多种机制产生，包括C9ORF72单倍体缺乏、C9ORF72 mRNA 病灶的形成（该病灶会封闭关键的 RNA 结合蛋白）以及非 AUG 启动的翻译（RAN 翻译）产生异常翻译产物。

C9ORF72 相关运动神经元疾病患者的特征是5种二肽重复序列（DPR）聚合物的异常表达。在这里，研究人员在小鼠神经元样细胞系（Neuro2a）中使用定量蛋白质组学来证明，与相对稀疏的惰性AP和GA结合相比，毒性最强的DPRS、PR 和GR中的Arg残基导致与蛋白质组的混杂结合。Poly-GR还募集精氨酸甲基化酶，诱导内源性蛋白的低甲基化，并诱导肌动蛋白细胞骨架的严重不稳定。研究结果表明，GR和PR聚合物中的精氨酸是翻译的多价毒素以及精氨酸甲基化，这可能解释了生物过程的功能障碍，包括核糖体生物发生，mRNA剪接和细胞骨架组装。

在这篇文章中，研究人员使用JuLI™ Stage活细胞成像分析系统进行活细胞成像。对细胞进行荧光标记，观察转染情况。从细胞转染24小时后开始追踪细胞，间隔15min拍摄一轮图片，共拍摄96h。mCherry荧光消失的时间点记录为细胞死亡。这一事件与细胞膜完整性的丧失和细胞死亡相对应，是通过不同途径和不同类型细胞死亡的高灵敏度和特异性检测方法。为了进行统计分析，生存时间被定义为细胞最后一次存活的成像时间点。使用GraphPad Prism软件，使用Kaplan-Meier曲线来估计生存和危险函数。Kaplan-Meier曲线的差异采用Log-rank（Mantel-Cox）检验进行评估。

图为转染了GFP标记的DPRs的Neuro-2a的Kaplan-Meier生存分析。根据表达DPR时的细胞存活率，poly-PR和poly-GR结构物的毒性最高，在10和101个长度上都是如此。相比之下，poly-GA仅在101个长度上有毒性，而其他DPRS没有毒性。

过表达含有GA101（上）或带有97Q重复序列的Httex1（下）的报告构建体的Neuro2a细胞的共聚焦图像。