混合淋巴细胞增殖实验也称混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR),常用于器官移植前的组织配型,以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA 抗原)相容的程度。
材料与仪器
器材:细胞培养瓶、培养板、吸管等、CO2 细胞培养箱、超净台。
试剂:
① 10%FCS-RPMI 1640 培养基 ;
② 细胞 DCs 细胞、反应细胞、外周血单个核细胞。
③ 3 H-TdR 工作液
步骤
混合淋巴细胞增殖实验的基本过程可分为如下几步:
一、刺激细胞(DCs)的制备
1. 取健康志愿者肝素抗凝的外周血,淋巴细胞分离液分离单个核细胞
2. 以 10% FCS-RPMI 1640 悬浮细胞置培养瓶中,37℃、5% CO2 培养 2 小时,轻轻翻过培养瓶,弃掉培养上清,将非贴壁细胞弃掉,即得贴壁的单核细胞
3. 补加 10% FCS-RPMI 1640 同时加入 20 ng/ml 的 hGM-CSF,500 IU/ml 的 IL-4,培养至第 7 天,收集悬浮细胞,即为 DCs
4. 刺激细胞经 25 μg/ml 的丝裂霉素 C 或 2000 rad y-射线照射处理使刺激细胞失去增殖能力。
二、反应细胞的制备
1. 取健康人外周血制备单核细胞,PBS 洗 3 次后,37℃、5% CO2 贴壁 2 小时,收集悬浮细胞,作为反应细胞
2. 以 RPMI 1640 培养液重悬,调整细胞浓度至 1x106 个/ml。
三、混合淋巴细胞反应
1. 将刺激细胞调整浓度分别为 1x106、5x105、2x10、1x105、5x104 个/ml, 10%FCS-RPMI 1640 培养于 96 孔培养板中,每浓度设立 3 孔,100μL/孔
2. 将反应细胞浓度按 1x106 个/ml 每孔分别加入上述各孔中,100μl/孔
3. 同时设立刺激细胞对照组(不同浓度刺激细胞 100μl+培养液 100μl)和反应细胞对照组(反应细胞 100μl+培养液 100μl)
4. 37℃,5% CO2 培养 5 天后,3 H-TdR 掺入率检测反应细胞的增殖水平。
步骤
1. 实验中注意无菌操作
2. 如作单向混合淋巴细胞实验,则刺激细胞接受照射剂量要准确,使细胞暂时存活,但失去增殖的能力。
奎克泰生物代理NanoEnTek的ADAMII™ LS图像型荧光细胞分析仪,是一款基于4通道(明场,GFP,RFP和DAPI)的图像型荧光细胞分析仪,适用于生命科学实验室。用户可通过它实现细胞的各种分析,包括细胞计数(总数和细胞核)、存活率、荧光表达、细胞凋亡、细胞生长周期,与流式细胞仪类似。
转载:
http://pro.biomart.cn/lab-web/method/31gq58ago3p47.html