肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，是比较容易培养的细胞。癌细胞形态不规则，细胞界限清晰，对营养要求不高，在体外培养可无限制传代而不凋亡。体外培养的细胞一旦建立细胞系就需要进行一系列细胞生物学特性鉴定。

肿瘤细胞可置于低温下保存。-80℃下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细胞5—10 年, 甚至更长的时间。

试剂：

液氮 EDTA 保种液

仪器及耗材：

恒温水浴锅 低温离心机 方瓶 CO2培养箱 -70度冰箱 弯管 显微镜 离心管 滤膜

操作

一、细胞复苏与培养

       将液氮或-80℃保存的肿瘤细胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培养基混匀已融化的肿瘤细胞悬液, 于1500 转/分, 离心3 分钟。弃上清, 再吸取8.0ml 培养基质混匀细胞沉淀, 再1500 转/分, 离心3 分钟, 弃上清, 细胞沉淀用1.0ml 培养基混匀, 备用。另取一个75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培养基质, 将上述制备的含肿瘤细胞悬液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵育箱中培养。若此肿瘤细胞悬浮生长, 大约3－4 天细胞基质会变黄, 5.0ml 细胞悬液可传代一个方瓶培养, 可用3－4 个方瓶培养, 一个方瓶中呈对数生长的肿瘤细胞可达1-1.5x107 个, 根据试验所需, 可决定传代的次数。若此肿瘤细胞呈贴壁生长, 经过3-4 天, 肿瘤细胞生长至80%-95% 单层时, 弃上清, 用0.5mM 的EDTA(难消化的肿瘤细胞用0.25%胰酶1.0ml), 处理肿瘤细胞大约3-5 分钟, 用倒置显微镜观察，当90% 的肿瘤细胞变圆时, 即可用弯管吹打并将消化的细胞转移到15ml 离心管中, 于1500 转/分下，离心3 分钟, 弃上清, 加少许培养基混匀, 可传代3 个 75cm2方瓶扩大培养。

二、细胞冻存

       将对数生长的肿瘤细胞用1 个75cm2方瓶按上述方法收集, 于1500 转/分离心3 分钟,弃上清, 用保种液(含10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混匀, 分别加入到2-3 只保种管中, 写上肿瘤细胞名称, 时间, 保种者姓名, 放-80℃保存, 次日将它们转移到液氮中保存(注: -80℃下可保存细胞半年至一年, 液氮可保存细胞5-10 年, 甚至更长的时间)。以上所有物品均需经过高温灭菌( 121℃, 30 分钟)，培养基质则经过过滤(0.22uM)除菌, 所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。

注意事项

所有操作均必须遵守无菌操作技术, 避免细菌、真菌、病原体、衣原体等污染。

苏州奎克泰生物为韩国NanoEnTek中国区独家总授权，JuLI系列活细胞成像仪深受赞誉。JuLI Br是一款明场的实时活细胞成像分析仪，实时观察/拍摄/记录细胞生长的全周期。镜头与底座分开，由数据线连接进行数据传输和电源提供；镜头可以放置在标准培养箱中，无需将样本拿出培养箱就可实现实时细胞生长状态观察、监测、记录、分析。通过设置拍摄时长和拍摄时间间隔可以通过视频和照片的方式将细胞全生长过程记录下来，避免错过关键时刻，无需全程守在培养箱旁。任何变化都可以通过培养箱外的底座观察到，底座配有触控屏，可以实时查看细胞状态和操作以获得细胞数量、存活率、浓度、融合度、细胞生长曲线等结果。这一款的计数功能是选配。Br的底座还可以同时连接两个镜头，实现对比实验的实时对照。 JuLI FL是一款带荧光（GFP/RFP）的实时活细胞影像分析仪，与JuLI Br外观一样，Br有的功能FL都具备，且计数功能是FL标配，无需选配。除了Br能实现的细胞计数、监测、拍照、形成视频、融合度、生长曲线等功能，FL还可以测定转染效率等级（GFP/RFP表达水平）。FL同样可以实现一个底座同时连接两个镜头，可搭配一个GFP镜头和一个RFP镜头，就能实现双色荧光+明场。 JuLI Stage是一款全自动活细胞荧光监控系统，具有三色荧光。与Br/FL一样可置于培养箱内实时观察/监测/拍摄细胞生长情况、计数细胞、计算细胞融合度、生成动态影像及生长曲线。Stage的载物台是可以移动的，适用6到384孔板、细胞培养皿、细胞培养瓶及各种玻片等培养耗材。能够实现自动扫描、自动对焦和图像拼接功能。Stage还自配4X、10X和20X三个可替换物镜，可以根据实验需要选择合适的物镜倍数。

转载：

http://www.biomart.cn/experiment/218.htm