研究背景

再生医学和组织工程的关键在于构建模拟生物组织力学特性和孔隙结构的支架。然而，现有技术难以同时实现孔隙大小和支架粘弹性的精确调控。

模拟宿主组织结构和力学的细胞负载支架对于广泛的生物医学应用非常重要，但生物打印仍具有挑战性。为了应对这些挑战，我们报告了一种称为触发式微孔形成生物打印的新方法。  这种方法可以产生具有确定结构和互连孔隙的细胞负载支架，孔隙大小不一，涵盖多种细胞类型。生物打印支架的粘弹性可以与生物组织的粘弹性相匹配，并且不受孔隙率和硬度的影响。  尽管孔隙率较高，但生物打印支架也表现出卓越的机械坚固性。生物打印方法和由此产生的支架支持细胞扩散、迁移和增殖。  三维生物打印系统在声带组织工程和体外癌症模型方面的潜力得到了证实。其他可能的应用还包括组织修复、再生医学、芯片器官、药物筛选、器官移植和疾病建模。

研究方法

1. 触发微孔形成机制

• 使用壳聚糖和聚乙二醇（PEG）作为生物墨水，通过pH诱导微相分离形成细胞级孔隙。

• 水凝胶的粘弹性通过改变PEG浓度调节，同时保持其结构完整性。

2. 生物打印与测试

• 打印多层支架并评估其机械性能、孔隙结构、降解特性及细胞相容性。

• 在支架中培养声带成纤维细胞（hVFFs）和癌细胞（MDA-MB-231），验证其组织工程和疾病建模能力。

触发式微孔形成（TMF）生物打印。(a)将含有细胞的生物墨水（深蓝色）通过 TMF 生物打印技术制成具有确定结构（特征尺寸 P）的支架。(b) 在相分离诱导基质（PSIM，浅蓝色）内形成的多孔粘弹性水凝胶（PVH），该基质支撑挤出的生物墨水并提供相分离诱导剂（灰色三角形），从而在高温下形成细胞大小的孔（孔径 p）。(c）以聚乙二醇（PEG）为交联剂调节 PVH 的粘弹性响应。粘弹性响应表现为恒定应变下的应力松弛。(d）分层多孔支架的荧光图像；比例尺为 2 毫米。(e）用罗丹明-B（红色）标记的生物打印支架内部微孔的共焦图像；比例尺为 30 微米。

主要发现

1. 支架结构与性能

• 打印的水凝胶具有高孔隙率（>60%）和细胞大小的互联孔隙（平均约17.8 µm）。

• 水凝胶储存模量范围为0.5–27 kPa，可覆盖大多数软组织的力学需求。

2. 细胞相容性与功能

• 水凝胶支持细胞扩展、迁移和增殖，细胞存活率始终超过90%。

• 高孔隙率显著提高了厚支架中的营养交换效率，避免了NEH（传统弹性水凝胶）中的中心坏死现象。

3. 应用场景

• 声带工程: 打印的双层支架能模拟声带的复杂层结构，促进细胞粘附和分布。

• 癌症模型: PVH支架中癌细胞的增殖和聚集行为随着粘弹性调节而变化，展现其对肿瘤侵袭性的影响。

结论与展望

1. 创新贡献

• TMF生物打印技术首次实现粘弹性、孔隙度和刚度的独立调控，显著扩展了生物打印材料的设计窗口。

2. 潜在应用

• 该技术可广泛应用于组织修复、疾病建模、药物筛选和器官移植等领域。

• 未来研究可进一步优化此方法并探索更多类型的生物墨水。

设备应用

在细胞运动研究中，用橙色 DNA 选择性染色剂（Invitrogen 公司，V35005）对活细胞进行染色，染色后立即将其嵌入壳聚糖水凝胶中。将含有细胞的水凝胶转移到无细胞粘附涂层的 8 孔培养板中，并使用JuLI Stage活细胞实时成像分析系统连续监测RFP通道超过48小时。

(e) hVFFs 在 PVH 内迁移的实时成像。两个移动的细胞分别用蓝色和绿色箭头标记，一个静止的细胞用黄色箭头标记，以供参考。(f）PVH 和 NEH 内的细胞运动。