研究背景

精确的基因组编辑对建立疾病模型和干细胞治疗至关重要。与 Cas9 介导的基因敲入不同，理想的情况下，胞嘧啶碱基编辑器和质粒编辑器能在不破坏 DNA 的情况下进行基因校正。但人类多能干细胞（hPSCs）的 DNA 修复机制活跃，容易发生 p53 依赖性细胞死亡，影响编辑效率。研究者发现，抑制 p53 介导的细胞死亡并激活 DNA 修复系统，或采用 BE4stem 系统和抑制错配修复活性的方法，可显著提高 hPSC 的基因编辑效率。因此，联合抑制不同细胞级联可增强 hPSC 的基因组精确编辑能力。

图1 由胞嘧啶碱基编辑器（CBE）、DNA 单链断裂（SSB）和尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UNG）介导的尿嘧啶切除过程组成的 DNA 损伤反应和 DNA 修复途径图

主要发现

1.      CBE系统中的双重抑制

实验表明，利用抑制p53依赖的细胞死亡（p53DD）和抑制BER路径（通过UNG抑制因子）共同作用，显著提高了CBE在hPSCs中C→T的碱基转换效率。该策略不仅改善了编辑效率，还减少了不期望的编辑产物，如C→G/A突变和插入缺失（indel）的生成。

2.      PE系统中的双重抑制

对PE编辑系统，在抑制MMR关键因子MLH1的同时抑制p53依赖的细胞死亡，可显著增强PE的编辑效率。与CBE类似，该双重抑制策略同样降低了潜在的脱靶效应和大规模基因组缺失风险。

3.      单载体系统优化

为了简化操作，该研究构建了单载体系统（AncBE4stem和PE4stem），整合了上述双重抑制模块，使编辑效率进一步提升并降低了潜在的编辑偏差和脱靶风险。

4.      p53突变对基因编辑的影响

在存在p53突变的hPSCs中，双重抑制策略的效果显著减弱，这一现象在有害基因突变修复中尤为关键。因此，研究建议在进行基因编辑前，需对细胞进行p53状态的检测，以保证编辑的有效性和安全性。

研究意义

这份研究通过双重抑制DNA损伤响应和修复路径的方式，提高了hPSCs中CBE和PE的基因编辑效率，并开发了一种更安全、易操作的单载体系统。

虽然，双重抑制策略的提出 为提升hPSCs基因编辑效率提供了一种新的思路，但在实际临床应用前，还是需要进一步评估其在不同细胞类型中的表现及长期安全性。

本研究中使用JuLI Stage活细胞实时成像分析系统进行明场活细胞成像和电穿孔后的细胞凋亡过程拍摄，数据使用标配JuLI STAT分析软件进行数据分析。

图2 通过活细胞成像和 SYTOX 染色检测基因编辑后的细胞死亡。转染用于 HEK3 的 gRNA 24 小时后开始成像。

图3 通过活细胞成像和 SYTOX 染色检测基因编辑后的细胞死亡。在转染用于 HEK4 ATCG 插入的 pegRNA 和 PE4 24 小时后开始成像。